RNAi介导的真菌耐药性

【摘要】

微生物通过有性生殖、拟有性生殖以及突变等机制进化。Silvia Calo等科学家发现致病真菌卷枝毛霉菌（Mucorcircinelloides）能通过两种机制自发形成对他克莫司（FK506）的耐药性。其一是孟德尔突变引起的稳定耐药性，其二是RNA干扰介导的不稳定的耐药性。FK506能通过抑制钙调磷酸酶而抑制菌丝的生长。基因fkbA、cnaA或cnbR的突变使得卷枝毛霉菌具有对FK506的耐药性。而RNA干扰能使fkbA基因沉默使得菌株获得抗性，fkbA反义小RNA的丰度能保证菌株的耐药性状态。

【正文】

FKBP12是一种脯氨酰基异构酶，其能与他克莫司或雷帕霉素形成复合物抑制钙调磷酸酶和Tor激酶，从而抑制了卷枝毛霉菌菌丝的生长。FkbA基因编码FKBP12蛋白，cnbR和cnaA分别编码钙调磷酸酶A亚基与B亚基。在筛选出的64个耐药性菌株中，45个菌株（70%）是由于这三个基因突变使得药物作用通路失效而导致突变。而在另外17个菌株（27%）中未检测到这三个基因的突变，之后的表达分析发现这些耐药性菌株在含FK506的培养基上生长时未能检测到其fkbAmRNA以及FKBP12蛋白的表达，而当这些菌株在不含任何药物的培养基上生长时部分菌株的fkbAmRNA以及FKBP12蛋白的表达水平低于正常水平但能检测到，而之后这些菌株完全恢复到野生型状态并对FK506敏感失去耐药性（图1,2）。

为了解答这个有趣的现象，研究人员先利用sRNA blot的方法检测fkbA反义链中小RNA的表达情况，发现在FK506培养基上生长的突变株以及在不含药物的YPD培养基上的突变株有较高的fkbA反义小RNA表达，而在不含药物的YPD培养基上的复原型菌株几乎无fkbA反义小RNA表达（图3）。同时对于这些反义小RNA序列的高通量测序结果显示，其片段大小集中在21到24nt之间，且片段5’末端大多以U结尾。这说明小RNA很有可能在耐药性的产生及消失中通过RNA干扰的方式发挥作用。

为了进一步验证是RNA干扰通路在卷枝毛霉菌的耐药性中发挥作用，研究人员试图在几个RNA干扰通路中发挥重要作用的蛋白突变菌株中筛选具有上述耐药模式的表观遗传突变株。结果发现在dcl2、Ago1和rdrp2突变株中未发现有之前所述耐药模式的菌株，且无内源性fkbA沉默的现象，同时未检测到其反义链上的小RNA信号（图4）。dcl2、Ago1和rdrp2分别编码在siRNA生成过程中的三个重要蛋白Dicer、Argonaute以及RDRP2。当这三个蛋白中的任意一个蛋白未能正常合成时，以他们为功能蛋白的siRNA的合成就会收到阻断。上述结果证明当siRNA合成通路受阻时，真菌的耐药性就无法正常产生，进一步证明RNA干扰的确在卷枝毛霉菌形成对FK506的耐药性中发挥决定性作用。

以小RNA的方式调控相应基因而对药物产生耐药性是一种全新的微生物耐药性形成机制，该表观遗传学机制对于微生物而言，能够更快地更灵活地应对外界的各种抑制因子。然而其上游调控的分子机制尚不清楚，值得继续深入探索。

参考文献:Silvia Calo, CeceliaShertz-Wall, et al. Antifungal drug resistance evoked via

RNAi-dependent epimutations.Nature.513, 555-558 (2014).