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发件人: 陆孝晨 [mailto:13301010007@fudan.edu.cn]
发送时间: 2017年5月16日 20:36
收件人: smwang2@fudan.edu.cn
主题: 分子生物学技术课程 疑问 陆孝晨 13基础医学
王老师好：
我是来自13基础医学的陆孝晨，今天上的表观遗传学研究方法和western实验我都挺感兴趣的，但也有一些疑问，打扰您了。
1，老师在讲到用甲基化敏感的限制性内切酶来分析整体水平甲基化的时候，有一处不明白的地方。MSRE识别含CpG岛双核苷酸序列，再通过非甲基化敏感的限制性内切酶酶切，得到DNA碎片？然后用杂交的方式来检测甲基化水平？我不理解的是酶切下来的片段是很小吗？否则仍然不能说明这段序列哪个位点发生了甲基化。
2，然后有一个概念不是很明白，杂交的时候老师提到芯片分析，但是我在网上搜到的都是关于meta分析的内容，老师能再提一句吗？
3，在做实验的过程中，有一处不理解的地方。最后转膜完胶上仍残留有许多的marker，是否暗示蛋白可能也有部分仍在胶上，我想的是会不会是最后大家都浇了很多的水，使得胶和膜之间有了一层水层，使得转膜效率不高？气泡我特地观察了没有。而且最后我发现膜的面积和胶上面残留的marker量好像并没有直接关系，并不是膜的面积小了，胶上marker残留就少了，这是困扰我的一点。
麻烦您了，感谢您的阅读。
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Thanks for reading 感谢阅读
Xiaochen Lu 陆孝晨
School of Basic Medical Sciences 基础医学院
Shanghai Medical University （SHMU）复旦大学上海医学院
Shanghai 200437
Email: 13301010007@fudan.edu.cn
对问题的回答：
甲基化敏感的限制性内切酶来分析整体水平甲基化，需要与正常图谱进行对照，来分析不同组织甲基化模式的异同和寻找同一组织内DNA的甲基化新靶点。
过去的放射性同位素方法一般步骤包括：
（1）用甲基化敏感的稀频限制性内切酶Not I消化基因组DNA，甲基化位点保留，同位素标记末端，切割，进行一维电泳
（2）随后用高频甲基化不敏感的内切酶切割，进行二维电泳
（3）得到的图谱与正常图谱对照得出缺失条带即为甲基化的可能部位
现在多采用芯片杂交的方法：差异甲基化杂交(DMH)包括 CpG岛微阵列的制备、标记靶序列的制备以及扫描图谱的分析。 甲基化敏感限制性内切酶对甲基化的CpG岛不切割，就没有与CpG岛特异的连接子进行连接，就不产生PCR产物，杂交信号弱。比如采用双色荧光标记肿瘤细胞与正常细胞的甲基化CpG岛，根据其混合物与CpG岛微阵列杂交后荧光信号的变化就获得肿瘤细胞CpG岛甲基化谱。哪些基因的CpG岛甲基化则是由芯片上的靶标读取出来的。芯片上的点代表了不同基因的CpG岛。限制性内切酶的方法可以知道一段DNA内该限制性内切酶识别位点的CpG的甲基化情况。
陆孝晨同学，你好！
很高兴，你对课程内容有兴趣，并提出了很好的问题
关于用限制性内切酶的方法分析基因组水平甲基化的问题，
甲基化敏感的限制性内切酶来分析整体水平甲基化，需要与正常图谱进行对照，来分析不同组织甲基化模式的异同和寻找同一组织内DNA的甲基化新靶点。
过去的放射性同位素方法一般步骤包括：
（1）用甲基化敏感的稀频限制性内切酶Not I消化基因组DNA，甲基化位点保留，同位素标记末端，切割，进行一维电泳
（2）随后用高频甲基化不敏感的内切酶切割，进行二维电泳
（3）得到的图谱与正常图谱对照得出缺失条带即为甲基化的可能部位
现在多采用芯片杂交的方法：差异甲基化杂交(DMH)包括 CpG岛微阵列的制备、标记靶序列的制备以及扫描图谱的分析。 甲基化敏感限制性内切酶对甲基化的CpG岛不切割，就没有与CpG岛特异的连接子进行连接，就不产生PCR产物，杂交信号弱。一般采用双色荧光标记肿瘤细胞与正常细胞的甲基化CpG岛，根据其混合物与CpG岛微阵列杂交后荧光信号的变化就获得肿瘤细胞CpG岛甲基化谱。哪些基因的CpG岛甲基化则是由芯片上的靶标读取出来的。芯片上的点代表了不同基因的CpG岛。限制性内切酶的方法可以知道一段DNA内该限制性内切酶识别位点的CpG的甲基化情况。是通过相对水平的比较得出的。
希望这个回答可以让你理解了MSRE的原理。
祝你学习愉快！