当前位置: 首页  1  教学方法  教案
教案

 

细胞损伤与保护系列实验

实验一实验用细胞的培养

实验内容:准备细胞损伤与保护系列实验用的细胞

主要实验技术:细胞传代与培养,细胞计数

分组:3人/每组,共8组
材料:CHL细胞(仓鼠肺上皮细胞)8瓶、胰酶4瓶、DNEM8瓶、计数板16块,、1ml加样器及枪头
要领:1、显微镜的使用(普通、倒置),包括光线、聚光器
      2、计数板的使用:
      3、胰酶消化细胞时间,用枪加2ml培液冲打制备悬液
      4、传代时取一滴直接滴在计数板上(2块/组),无菌室外计数

 

 

 
 
 细胞损伤与保护系列实验

实验二细胞损伤与修复

实验内容:细胞缺糖损伤与恢复有糖培养后的变化

主要实验技术:MTT法检测细胞活力,细胞器的分离与鉴定

材料:
1、          96孔板8块:
2个班公用1块板,使用前照射半小时8组,96孔板重复使用,周边留空。每组接种细胞9孔、200ul。每班
2、          细胞7瓶:
4瓶传代——8瓶
2瓶(每桌1瓶)加2ml培液悬液,弃1ml后再加10mlDMEM液,每组9孔,200ul做MTT
1瓶加6mlDMEM液接种小盖3瓶(电镜)
操作:
 一、-实验前2天中午饭后,细胞传代接种:
    小盖片培养瓶3瓶(1组) 96孔板9孔(8组)
      25ml培养瓶8瓶( 4组)
二、次日中午饭前,细胞换液(损伤)
   13瓶含小盖片培养瓶(电镜)
      2瓶正常、4瓶损伤
   2、每组96孔板9孔(活率)
      3孔正常、6孔损伤
三、下午课后5点,细胞换液(损伤恢复)
     4瓶损伤小盖片中2瓶、 6孔损伤中3
四、下午1:30继续实验
要领:1、细胞接种时要计数,以计算出接种量,约2ml冲打后,再加10ml
2、          一上课即加MTT
3、          蔗糖密度与细胞器的密度接近,使得细胞器在差速离心时更好分离细胞器
     4、酶标仪的使用
 
 
 
 
 
 细胞损伤与保护系列实验

实验三细胞损伤与保护后的形态改变以及细胞中保护蛋白的表达

实验内容:细胞缺糖以及恢复有糖培养后hsp70的表达

主要实验技术:免疫细胞化学,显微镜摄影

材料与操作:
        96孔板8块、CHL细胞
        2个班公用1块板,使用前照射半小时。每班8组,96孔板重复使用,周边留空。每组接种细胞6孔、200ul
        细胞消化后,加2ml培液,弃1ml后,再加10ml培液,全班共加48孔,960ul
        做细胞损伤模型(与实验二同),但要再提早一天,实验前一天要饭前洗涤、固定、封闭、饭后课前加一抗(hsp抗体)
        上午课后洗涤加二抗,下午2:00上课
要领:1、严格按照操作时间
2、洗涤要轻,吸用抢,加用滴管,稍倾斜,(细胞易脱落)
3、终止时间镜下控制约30”
4、电脑成像系统
 
 
 
 
 
医学遗传(遗传病分析)系列实验

实验四染色体分析I

实验内容:染色体标本制备与分析

主要实验技术:染色体标本制备

操作及要点:
外周血淋巴细胞的染色体制备
1、外周血以肝素抗凝
2、PHA作用刺激淋巴细胞幼稚化,注意PHA浓度及作用时间
3、注意秋水仙素的作用原理、时间和浓度
4、标本制片时,须用冰玻片
动物体细胞染色体标本制备
1、前2天下班前接种16瓶小盖片
     2、次日上午10:00加环磷酰胺1mg/ml,加50ul混匀
     实验间隙播放各种染色体技术的实验录像
 
 
 
 
 
 医学遗传(遗传病分析)系列实验
 

实验五 染色体分析II

实验内容:染色体标本制备与分析

主要实验技术:染色体标本制备,G显带,染色体核型分析
原理:
秋水仙素作用阻断纺锤丝形成
纺锤丝有微管合成
纺锤体包括中心粒和纺锤丝
分裂期时DNA含量多1倍
间期是染色质,松散均匀分布在核内
操作:1 上次制片作G显带,注意片子老化的时间、
      2 学习G显带后的核型分析,学习识别染色体
      3 氏综合征一例示教(学习使用遗传工作站分析)
 
 
 
 
 
 医学遗传(遗传病分析)系列实验
 
 

实验六基因病的分析与分子诊断I

实验内容:线粒体基因突变的分子诊断

主要实验技术: DNA抽提,PCR

原理:
Leber氏为线粒体DNA突变引起。导致细胞氧化和呼吸链功能障碍。线粒体DNA存在于细胞质中。密切相关的线粒体DNA位点是:3460、11778特异性点突变。
引物 1(68kb上游)、引物 2(69kb下游)是11778位点的DNA片段的上下游引物
924bp的扩增产物中含有了11778位点的无数DNA片段
操作:
1、          Leber’s病一例,抽提DNA
2、          PCR扩增目的基因
3、          绘制分析该病例的系谱,分析其遗传特点
 
 
 
 
 
 医学遗传(遗传病分析)系列实验
 
 

实验七基因病的分析与分子诊断II

实验内容:线粒体基因突变的分子诊断与家系分析

主要实验技术:扩增基因的酶切与鉴定

操作:
1、          实验六扩增所得目的基因以限制性内切酶酶切
2、          电泳鉴定(电泳,eagle eye鉴定)
根据实验六对该疾病的家系分析的结果,复习系谱分析在基因病诊断与咨询中的作用。以双眼睑、卷发、拇指关节外翻等10个性状作每个学生本人家系的系谱分析,以模拟遗传病诊断、咨询时的系谱分析。
1 2 3 4 5 6 7